中药杜仲抗 HIV作用的实验研究

    孙燕荣 , 董俊兴①, 吴曙光

    (第一军医大学药物研究所 ,广州 , 510515)

    摘要: 目的 观察中药杜仲及其单体化合物抗 HIV 作用 ,为寻找新的有效治疗艾滋病药物

    提供实验依据。方法 用植物化学的方法从中药杜仲中提取单体化合物;以 HIV病毒感染的MT4

    细胞为实验模型 ,以病毒引起合胞体的产生为评价指标 ,观察药物的作用。结果 从中药杜仲中

    获得6个单体化合物 ,其中氯原酸、咖啡酸、表儿茶素、儿茶素等4个单体化合物可有效保护病毒

    感染的细胞 ,使其不产生病变。咖啡酸和儿茶素的效果尤为显著 , IC50值均为 50μg. mL - 1。结论

    杜仲提取物及其单体化合物具有抗 HIV作用 ,儿茶素作用为新的发现。

    关键词: 杜仲; 化合物; 抗 HIV ; 病变

    中图分类号:R77. 1 +

    5 文献标识码:A 文章编号:1001 - 5248(2004) 02 - 0101 - 03

    迄今为止对艾滋病病毒的彻底清除 ,尚无十分

    有效的治疗药物和手段〔 1〕。现在临床上所用的

    AIDS治疗药物 ,一般都存在副作用大 ,易产生耐药

    性和停药反弹等诸多问题〔 2〕。急待寻求有效、无毒、价廉、可长期使用的药物 ,所以 ,从天然中草药中寻

    找抗 HIV 活性成分引起广泛关注。中药杜仲是杜

    仲科杜仲属植物杜仲 Eucommia ulmoides Oliv 的干燥

    树皮 ,俗称木棉、丝连皮等〔 3〕。杜仲为常用名贵传统

    中药之一 , 《药典》记载杜仲具“补肝肾”等作用。由

    于杜仲独特的药用价值和潜在的经济价值 ,国内外

    学者对其化学成分和生物活性作了大量的研究。天

    然产物往往具有独特的化学结构 ,是寻找新药的重

    要宝库。前期实验研究结果表明 ,中药杜仲具有一

    定的抗 HIV 作用。为了进一步证实杜仲的抗 HIV

    作用 ,并寻找具有活性的单体化合物 ,采用抗 HIV

    药物筛选模型并运用植物化学分离技术和波谱学手

    段对其活性成分进行了药效学评价。

    1 材料与方法

    1. 1 药物 中药杜仲 ,购自广州南方医院中药房;

    单体化合物(实验中分得) ;AZT(zidovudine ,购自 Sig2

    ma公司) 。中药采用 95 %的乙醇回流提取 ,减压浓

    缩至干 ,得醇提物。对醇提物依次进行萃取 , 得氯

    作者简介:孙燕荣(1973 - ) ,女,博士研究生,主管药师。从事免疫药

    理学研究。

    ①军事医学科学院放射医学研究所

    仿、乙酸乙酯、正丁醇、水4部分萃取物。

    1. 2 试剂 DMSO :军事医学科学院进口分装;培养

    基 RPMI - 1640 :Vinvitrogen 公司;小牛血清:杭州四

    季青生物工程材料有限公司。

    1. 3 细胞和病毒 HIV - 1 ⅢB 引自美国;MT4 细

    胞株引自日本;细胞培养在全军艾滋病检测中心(P3

    实验室)进行。样品用DMSO溶解。

    1. 4 化合物对细胞的毒性测定 将 MT4 细胞 2 ×

    105

    · mL - 1

    接种于96 孔板中 ,每孔 0. 1 mL ,加入验证

    化合物 (以 DMSO 连续 2 倍稀释成 1 000～7. 8

    μg· mL - 1) ; 对阳性对照药AZT3倍稀释为500～6. 3

    μg· mL - 1

    ,每个浓度接种 3 孔 ,同时设正常细胞对

    照 ,DMSO溶剂对照及空白 MT4 细胞对照(不加病

    毒) ,置37 ℃、 5 %CO2 培养箱内培养 6 d。MTT法测

    定细胞活性 ,确定 CC50值〔 4〕。

    1. 5 化合物对 HIV诱导MT4 细胞病变的抑制作用

    病毒毒力测定用10倍稀释 8 个浓度 HIV ,在培养液

    RPMI - 1640 中观察细胞病变 ,计算 TCID50为 10 - 6。

    将MT4细胞2 × 105

    · mL - 1

    接种于 96 孔板中 ,每孔为

    0. 1 mL ,分别加入1 000×TCID50的 HIV病毒100μ L ,同时设正常细胞对照和病毒对照 ,然后分别加入 2

    倍稀释 5 个浓度的样品及 AZT 100μ L ,每个样品浓

    度均设 3 个平行孔 ,置 37 ℃、 5 %CO2 培养箱内培

    养 ,72 h后在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)

    〔 5〕。

    CPE判定标准:无合胞体形成“- ”,无合胞体形

    成但细胞不规则“±” ,有无合胞体形成“+”。IC50的

    · 101 · 解放军预防医学杂志 2004年4月 第22卷第2期 J Prev Med Chin PLA April 2004 Vol . 22 No. 2

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.判定: (1) 只 1 孔为“+ ”,另两孔为“- ”或“- ”与

    “±” ,此药物浓度可视为 EC50。( 2) 3 孔分别为

    “+”、“- ”与“±” ,此药物浓度可视为 EC50。(3) 3

    孔均为“±” ,此药物浓度可视为 EC50。(4) 3孔均为

    “+”,下一个浓度作用下的3孔均为“- ”,两个浓度

    的中间值可视为 IC50。选择指数(SI) :CC50 IC50。

    2 结果

    2. 1 单体化合物的分离鉴定 采用植物化学的方

    法 ,从中药杜仲中分得4个酚酸类化合物 ,通过波谱

    分析 ,确定其为绿原酸、香草酸、咖啡酸和原儿茶酸;

    两个黄酮类化合物确定为表儿茶素和儿茶素。

    2. 2 杜仲醇提物及萃取部位抗 HIV 作用的结果

    从表1可见 ,杜仲醇提物具有显著的抗 HIV 作用 ,IC50值为25μg· mL - 1。4 个萃取部位中 ,氯仿、乙酸

    乙酯具有抗 HIV 作用 , IC50值分别为 50μg· mL - 1

    和

    25μg· mL - 1。正丁醇及水部位无效。筛选结果表

    明 ,杜仲的氯仿和乙酸乙酯部位具有抗 HIV 活性 ,说明活性成分主要为中等极性的化合物 ......